{"id":27633,"date":"2023-06-02T10:48:22","date_gmt":"2023-06-02T09:48:22","guid":{"rendered":"https:\/\/www.kapelanbio.com\/?p=27633"},"modified":"2026-01-20T09:54:03","modified_gmt":"2026-01-20T09:54:03","slug":"faerbemethoden-fuer-1d-gele-und-blots","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.kapelanbio.com\/de\/faerbemethoden-fuer-1d-gele-und-blots\/","title":{"rendered":"F\u00e4rbemethoden f\u00fcr 1D Gele und Blots und ihre Auswertung in LabImage 1D"},"content":{"rendered":"<style><\/style>\t\t<div data-elementor-type=\"wp-post\" data-elementor-id=\"27633\" class=\"elementor elementor-27633\" data-elementor-post-type=\"post\">\n\t\t\t\t\t\t<section class=\"elementor-section elementor-top-section elementor-element elementor-element-f302c7d elementor-section-boxed elementor-section-height-default elementor-section-height-default\" data-id=\"f302c7d\" data-element_type=\"section\" data-e-type=\"section\">\n\t\t\t\t\t\t<div class=\"elementor-container elementor-column-gap-default\">\n\t\t\t\t\t<div class=\"elementor-column elementor-col-100 elementor-top-column elementor-element elementor-element-82be4ac\" data-id=\"82be4ac\" data-element_type=\"column\" data-e-type=\"column\">\n\t\t\t<div class=\"elementor-widget-wrap elementor-element-populated\">\n\t\t\t\t\t\t<div class=\"elementor-element elementor-element-8dc8528 elementor-widget elementor-widget-text-editor\" data-id=\"8dc8528\" data-element_type=\"widget\" data-e-type=\"widget\" data-widget_type=\"text-editor.default\">\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t<p><strong>White Paper f\u00fcr LabImage 1D: <\/strong><strong>Unterschiedliche F\u00e4rbemethoden nach einer 1D-Gelelektrophorese<\/strong><\/p><p>In der Labordiagnostik gibt es unterschiedliche Methoden zur Quantifizierung von Protein- oder DNA-\/RNA-Banden nach einer gelelektrophoretischen Auftrennung. Dabei gilt es zun\u00e4chst, die noch unsichtbaren Banden sichtbar zu machen, um ihre Intensit\u00e4t dann im zweiten Schritt mithilfe einer entsprechenden Kalibrierungskurve in einem Zahlenwert darstellen zu k\u00f6nnen. Dieser zweite Schritt erfolgt durch eine Auswertung der entsprechenden Bilddatei mit der von Kapelan Bio-Imaging erstellten Software LabImage 1D. Die Genauigkeit und Aussagekraft der gewonnenen Daten h\u00e4ngt direkt mit der gew\u00e4hlten F\u00e4rbemethode und der Qualit\u00e4t der Durchf\u00fchrung der F\u00e4rbung zusammen. Je spezifischer die F\u00e4rbung ist und je sauberer gearbeitet wurde, desto genauer sind auch die daraus abgeleiteten Ergebnisse.<\/p><p>F\u00fcr die eher allgemeine F\u00e4rbung von Proteinen, DNA oder RNA direkt auf dem Gel werden folgende Methoden am h\u00e4ufigsten verwendet. Hierbei werden die nach Gr\u00f6\u00dfe aufgetrennten Banden gef\u00e4rbt, ohne dass ein spezifisches Zielmolek\u00fcl exakt detektiert wird. Diese Verfahren verhelfen in erster Linie zu einem schnellen \u00dcberblick innerhalb eines gro\u00dfen Probevolumens. Eine exakte Quantifizierung mit Mengenbestimmung ist aufgrund der unspezifischen F\u00e4rbung sowie einer breiten Streuung und Hintergrundf\u00e4rbung eher schwierig, allerdings auch oftmals nicht notwendig. Oftmals geht es hier vielmehr um eine erste Sortierung in positive und negative Proben. Solche schnellen Scans k\u00f6nnen durch automatisierte Programmschleifen mit LabImage 1D auch bei sehr gro\u00dfen Probenvolumina rasch und einfach vorgenommen werden.<\/p><ol><li><strong>Coomassie-Blau<\/strong><\/li><\/ol><p>Die Coomassie-Blau-F\u00e4rbung ist eine einfache und g\u00fcnstige F\u00e4rbemethode zur Visualisierung von Proteinen. Dabei bindet der Farbstoff an basische und aromatische Aminos\u00e4urereste, wie sie z. B. bei Arginin, Histidin, Lysin oder Tryptophan vorliegen. Die Coomassie-Blau-F\u00e4rbung ist ein endg\u00fcltiger Schritt, sodass keine weiteren Analysen mehr durchgef\u00fchrt werden k\u00f6nnen, nachdem die Probe gef\u00e4rbt wurde. Aufgrund des g\u00fcnstigen Preises und der einfachen Handhabung ist diese F\u00e4rbung ideal, wenn es einen gro\u00dfen Durchlauf an Proben gibt.<\/p><p>Aufgrund der oft nicht gerade laufenden Spuren ist der Spurmodus \u201egebogene Spur\u201c sinnvoll. Die Bandenerkennung liefert mit den Standardmodi sehr gut Ergebnisse. Bei der Hintergrundkorrektur wird \u00fcberwiegend der Rolling Ball genutzt. Das Hintergrundlevel ist eher gering, sodass die Korrektur nicht sehr tiefgreifend ist.<\/p><p>Beachten sollte man aber die Bandengrenzen. Diese haben einen sehr deutlichen Einfluss auf die Bandenvolumen. Da LabImage die Struktur der Gels\/Blots selber ermittelt, muss keine Invertierung erfolgen. Erkennbar w\u00e4re dies anhand nach unten laufender Bandenpeaks im Profil. Hier kann man im Bereich Vorverarbeitung die Invertierung vornehmen.\u00a0\u00a0\u00a0 \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0<\/p><ol start=\"2\"><li><strong>Silberf\u00e4rbung<\/strong><\/li><\/ol><p>Die Silberf\u00e4rbung wird meist f\u00fcr den Nachweis von Proteinen verwendet, an denen sich die aufgetragenen Silberionen mit hoher Affinit\u00e4t anheften. Sie binden aber auch an Phosphatgruppen, die Teil von RNA und DNA sind, sodass Silber grunds\u00e4tzlich auch f\u00fcr die F\u00e4rbung von DNA- oder RNA-Proben verwendet werden kann. Allerdings ist die Empfindlichkeit hier so gering, dass andere F\u00e4rbemethoden zu bevorzugen sind. F\u00fcr Proteine ist die Silber-F\u00e4rbung bis zu 10-mal empfindlicher als die Coomassie-Blau-F\u00e4rbung und kann dadurch auch sehr geringe Proteinmengen besser detektieren. Die Durchf\u00fchrung ist allerdings aufwendiger und teurer.<\/p><p>Die Silberf\u00e4rbung f\u00fchrt oft zu auslaufenden, nicht geraden Spuren. Hierzu nutzt man am Besten die Spurenmodi \u201egebogene Spur\u201c. Da oft die Spuren nach unten hin breiter werden, muss die Gesamtbreite so gesetzt sein, dass die Breite an der Lauffront die Gesamtbreite vorgibt. \u00dcberlappungen der Spuren werden in der LabImage von Hause aus nicht erlaubt. Bei der Hintergrundkorrektur sollte der Modus \u201eRolling Ball\u201c verwendet werden. Je nach Struktur ist auch \u201eMinimum zu Minimum\u201c sinnvoll. Hier kann \u00fcber den Steigungsparameter der Anstieg zum n\u00e4chsten Minimum angepasst werden.\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0<\/p><ol start=\"3\"><li><strong>Ethidiumbromid-F\u00e4rbung<\/strong><\/li><\/ol><p>Die Ethidiumbromid-F\u00e4rbung ist eine spezifische Methode zur Detektion von Nukleins\u00e4uren nach einer Gel-Elektrophorese. Der Farbstoff lagert sich in den DNA- oder RNA-Str\u00e4ngen an und gibt fluoreszierendes Licht ab, wenn das Gel mit UV-Licht bestrahlt wird. Die Methode ist sehr empfindlich und kann bereits sehr geringe Mengen von DNA oder RNA detektieren. Gleichzeitig ist sie relativ schnell und einfach durchzuf\u00fchren. Allerdings ist Ethidiumbromid ein karzinogenes Agens, sodass angemessene Vorsicht und spezielle Schutzma\u00dfnahmen angebracht sind. Dar\u00fcber hinaus kann Ethidiumbromid bei ungenauer Anwendung die Probe sch\u00e4digen und dadurch die Bandenintensit\u00e4t beeintr\u00e4chtigen.<\/p><p>Die Ethidiumbromid-F\u00e4rbung bei DNA Gelen ist trotz seiner karzinogenen Wirkung eine sehr weit verbreitete Methode und l\u00e4sst sich sehr robust in der LabImage 1D abarbeiten. Wichtig bei der Auswertung ist es wie bei allen anderen Methode auch, dass die Auswerte-ROI (Region of Interest) sehr knapp gesetzt wird. Spuren und Banden werden sehr gut automatisch gefunden, sodass keine oder nur wenig manuelle Nacharbeit erfolgen muss. Bei der Hintergrundkorrektur kann aufgrund des eher homogenen Hintergrundes sogar mit einer Basislinie gearbeitet werden. Gute Ergebnisse liefert auch hier der \u201eRolling Ball\u201c.\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0<\/p><ol start=\"4\"><li><strong>SYBR Green-F\u00e4rbung<\/strong><\/li><\/ol><p>SYBR Green bindet spezifisch an Nukleins\u00e4uren und wird insbesondere f\u00fcr den Nachweis von DNA verwendet. Mit wenigen Abstrichen l\u00e4sst sich allerdings auch RNA gut nachweisen. Der Farbstoff lagert sich in den Str\u00e4ngen der Molek\u00fcle ein und gibt ein fluoreszierendes Licht ab, wenn es mit UV-Licht bestrahlt wird. Die Methode ist sehr empfindlich und kann sehr geringe Mengen von DNA detektieren. Im Vergleich zur Ethidiumbromid-F\u00e4rbung ist SYBR Green weniger toxisch, allerdings teurer. Da der Nachweis mit SYBR Green sehr empfindlich ist, ist diese Methode auch anf\u00e4llig f\u00fcr Verunreinigungen, was zu einem hohen Hintergrundrauschen f\u00fchren kann.<\/p><p>Als Methode zur Hintergrundkorrektur sollte man demnach auch den \u201eRolling Ball\u201c verwenden. Die Detektion der Spuren und Banden ist weitgehend vollautomatisch m\u00f6glich. Da es bei den Banden meist zu schr\u00e4gen Lagen kommen kann, kann man das Grimassentool verwenden, um Banden zu trennen. Dies korrigiert die Lage der Bande virtuell so, dass keine Banden im Profil \u201eineinander laufen\u201c und damit sauber getrennt werden k\u00f6nnen. Wichtig ist dies vor allem bei der Quantifizierung von Banden. \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0<\/p><p>Die erl\u00e4uterten Methoden werden meist f\u00fcr eine erste Vorselektion verwendet. Wenn es jedoch darum geht, bestimmte Proteine, DNA- oder RNA-Molek\u00fcle in einer Probe zu detektieren, m\u00fcssen Nachweissysteme verwendet werden, die spezifisch sind und eine Quantifizierung von klar definierten Teilen der Gesamtprobe erm\u00f6glichen. Das Ergebnis solcher Verfahren erlaubt eine Mengenbestimmung des enthaltenen Zielmolek\u00fcls innerhalb einer Probe anhand einer Kalibrierungskurve. Mithilfe von LabImage 1D kann die Analyse entsprechender Bilddateien nach konstanten Kriterien auch automatisiert erfolgen, sodass gro\u00dfe Datenmenge rasch und reproduzierbar bearbeitet werden k\u00f6nnen. F\u00fcr spezifische Nachweisverfahren gibt es grunds\u00e4tzlich zwei verschiedene M\u00f6glichkeiten:<\/p><ol><li><strong>Spezifischer Nachweis direkt auf dem Gel<\/strong><\/li><\/ol><p>F\u00fcr den Nachweis bestimmter Proteine direkt im Gel kann eine Immunf\u00e4rbung durchgef\u00fchrt werden. Dabei wird das Gel in einer L\u00f6sung mit spezifischen Antik\u00f6rpern inkubiert, die an das gew\u00fcnschte Protein binden. Diese Antik\u00f6rper werden dann im zweiten Schritt durch einen sekund\u00e4ren Antik\u00f6rper markiert, der einen Farbstoff (in der Regel fluoreszierend) oder ein Enzym tr\u00e4gt, wodurch die Bindung schlie\u00dflich sichtbar gemacht werden kann. Analog hierzu erfolgt der Nachweis bestimmter DNA- oder RNA-Str\u00e4nge durch Hybridisierung. Dabei werden spezifischer Sonden verwendet, die quasi das Gegenst\u00fcck des nachzuweisenden Molek\u00fclabschnittes sind und ebenfalls einen Farbstoff oder ein Enzym tragen, um die Bindung im n\u00e4chsten Schritt sichtbar zu machen.<\/p><ol start=\"2\"><li><strong>Blotting-Verfahren<\/strong><\/li><\/ol><p>Beim Blotting werden die aufgetrennten Proben aus dem Gel auf eine Nitrozellulose- oder PVDF-Membran \u00fcbertragen. Der Nachweis des spezifischen Molek\u00fcls erfolgt auch hier durch die jeweiligen speziellen Antik\u00f6rper oder Sonden. Blotting-Verfahren sind in der Regel sensitiver als direkte Nachweisverfahren in dem Gel, da sie eine h\u00f6here Nachweisempfindlichkeit haben. Dies liegt daran, dass die \u00dcbertragung der Proteine oder Nukleins\u00e4uren vom Gel auf die Blotting-Membran eine h\u00f6here Konzentration und Reinheit des Zielmolek\u00fcls erm\u00f6glicht. Allerdings sind Blotting-Verfahren auch aufwendiger und dadurch teurer als direkte Nachweisverfahren auf dem Gel. Western Blotting wird zur Detektion und Charakterisierung von Proteinen, Southern Blotting zur Detektion spezifischer DNA-Sequenzen und Northern Blotting zur Detektion von RNA-Sequenzen verwendet.<\/p><p>Zusammenfassend l\u00e4sst sich feststellen, dass es viele Methoden gibt, ein Gel nach der Auftrennung der Probe zu F\u00e4rben. Die Wahl dieser Methode h\u00e4ngt von den spezifischen Anforderungen und der Verf\u00fcgbarkeit von Ressourcen ab. Am Ende steht immer ein Bild mit mehreren oder einzelnen Banden, die \u00fcber eine Messung der optischen Dichte quantifiziert werden k\u00f6nnen. Hierbei kann eine definierte Zielgr\u00f6\u00dfe sowohl qualitativ als auch quantitativ bestimmt werden. LabImage 1D kann die entsprechende Auswertung automatisiert durchf\u00fchren, sodass ein gro\u00dfer Probendurchlauf und konstanten Vergleichsbedingungen gegeben sind. Die Genauigkeit dieser Quantifizierung steht und f\u00e4llt mit der Sensitivit\u00e4t und Spezifit\u00e4t des verwendeten Nachweisverfahrens.<\/p>\t\t\t\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/section>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>White Paper f\u00fcr LabImage 1D: Unterschiedliche F\u00e4rbemethoden nach einer 1D-Gelelektrophorese In der Labordiagnostik gibt es unterschiedliche Methoden zur Quantifizierung von Protein- oder DNA-\/RNA-Banden nach einer gelelektrophoretischen Auftrennung. Dabei gilt es zun\u00e4chst, die noch unsichtbaren Banden sichtbar zu machen, um ihre Intensit\u00e4t dann im zweiten Schritt mithilfe einer entsprechenden Kalibrierungskurve in einem Zahlenwert darstellen zu k\u00f6nnen. 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