White Paper für LabImage 1D: Unterschiedliche Färbemethoden nach einer 1D-Gelelektrophorese
In der Labordiagnostik gibt es unterschiedliche Methoden zur Quantifizierung von Protein- oder DNA-/RNA-Banden nach einer gelelektrophoretischen Auftrennung. Dabei gilt es zunächst, die noch unsichtbaren Banden sichtbar zu machen, um ihre Intensität dann im zweiten Schritt mithilfe einer entsprechenden Kalibrierungskurve in einem Zahlenwert darstellen zu können. Dieser zweite Schritt erfolgt durch eine Auswertung der entsprechenden Bilddatei mit der von Kapelan Bio-Imaging erstellten Software LabImage 1D. Die Genauigkeit und Aussagekraft der gewonnenen Daten hängt direkt mit der gewählten Färbemethode und der Qualität der Durchführung der Färbung zusammen. Je spezifischer die Färbung ist und je sauberer gearbeitet wurde, desto genauer sind auch die daraus abgeleiteten Ergebnisse.
Für die eher allgemeine Färbung von Proteinen, DNA oder RNA direkt auf dem Gel werden folgende Methoden am häufigsten verwendet. Hierbei werden die nach Größe aufgetrennten Banden gefärbt, ohne dass ein spezifisches Zielmolekül exakt detektiert wird. Diese Verfahren verhelfen in erster Linie zu einem schnellen Überblick innerhalb eines großen Probevolumens. Eine exakte Quantifizierung mit Mengenbestimmung ist aufgrund der unspezifischen Färbung sowie einer breiten Streuung und Hintergrundfärbung eher schwierig, allerdings auch oftmals nicht notwendig. Oftmals geht es hier vielmehr um eine erste Sortierung in positive und negative Proben. Solche schnellen Scans können durch automatisierte Programmschleifen mit LabImage 1D auch bei sehr großen Probenvolumina rasch und einfach vorgenommen werden.
- Coomassie-Blau
Die Coomassie-Blau-Färbung ist eine einfache und günstige Färbemethode zur Visualisierung von Proteinen. Dabei bindet der Farbstoff an basische und aromatische Aminosäurereste, wie sie z. B. bei Arginin, Histidin, Lysin oder Tryptophan vorliegen. Die Coomassie-Blau-Färbung ist ein endgültiger Schritt, sodass keine weiteren Analysen mehr durchgeführt werden können, nachdem die Probe gefärbt wurde. Aufgrund des günstigen Preises und der einfachen Handhabung ist diese Färbung ideal, wenn es einen großen Durchlauf an Proben gibt.
Aufgrund der oft nicht gerade laufenden Spuren ist der Spurmodus „gebogene Spur“ sinnvoll. Die Bandenerkennung liefert mit den Standardmodi sehr gut Ergebnisse. Bei der Hintergrundkorrektur wird überwiegend der Rolling Ball genutzt. Das Hintergrundlevel ist eher gering, sodass die Korrektur nicht sehr tiefgreifend ist.
Beachten sollte man aber die Bandengrenzen. Diese haben einen sehr deutlichen Einfluss auf die Bandenvolumen. Da LabImage die Struktur der Gels/Blots selber ermittelt, muss keine Invertierung erfolgen. Erkennbar wäre dies anhand nach unten laufender Bandenpeaks im Profil. Hier kann man im Bereich Vorverarbeitung die Invertierung vornehmen.
- Silberfärbung
Die Silberfärbung wird meist für den Nachweis von Proteinen verwendet, an denen sich die aufgetragenen Silberionen mit hoher Affinität anheften. Sie binden aber auch an Phosphatgruppen, die Teil von RNA und DNA sind, sodass Silber grundsätzlich auch für die Färbung von DNA- oder RNA-Proben verwendet werden kann. Allerdings ist die Empfindlichkeit hier so gering, dass andere Färbemethoden zu bevorzugen sind. Für Proteine ist die Silber-Färbung bis zu 10-mal empfindlicher als die Coomassie-Blau-Färbung und kann dadurch auch sehr geringe Proteinmengen besser detektieren. Die Durchführung ist allerdings aufwendiger und teurer.
Die Silberfärbung führt oft zu auslaufenden, nicht geraden Spuren. Hierzu nutzt man am Besten die Spurenmodi „gebogene Spur“. Da oft die Spuren nach unten hin breiter werden, muss die Gesamtbreite so gesetzt sein, dass die Breite an der Lauffront die Gesamtbreite vorgibt. Überlappungen der Spuren werden in der LabImage von Hause aus nicht erlaubt. Bei der Hintergrundkorrektur sollte der Modus „Rolling Ball“ verwendet werden. Je nach Struktur ist auch „Minimum zu Minimum“ sinnvoll. Hier kann über den Steigungsparameter der Anstieg zum nächsten Minimum angepasst werden.
- Ethidiumbromid-Färbung
Die Ethidiumbromid-Färbung ist eine spezifische Methode zur Detektion von Nukleinsäuren nach einer Gel-Elektrophorese. Der Farbstoff lagert sich in den DNA- oder RNA-Strängen an und gibt fluoreszierendes Licht ab, wenn das Gel mit UV-Licht bestrahlt wird. Die Methode ist sehr empfindlich und kann bereits sehr geringe Mengen von DNA oder RNA detektieren. Gleichzeitig ist sie relativ schnell und einfach durchzuführen. Allerdings ist Ethidiumbromid ein karzinogenes Agens, sodass angemessene Vorsicht und spezielle Schutzmaßnahmen angebracht sind. Darüber hinaus kann Ethidiumbromid bei ungenauer Anwendung die Probe schädigen und dadurch die Bandenintensität beeinträchtigen.
Die Ethidiumbromid-Färbung bei DNA Gelen ist trotz seiner karzinogenen Wirkung eine sehr weit verbreitete Methode und lässt sich sehr robust in der LabImage 1D abarbeiten. Wichtig bei der Auswertung ist es wie bei allen anderen Methode auch, dass die Auswerte-ROI (Region of Interest) sehr knapp gesetzt wird. Spuren und Banden werden sehr gut automatisch gefunden, sodass keine oder nur wenig manuelle Nacharbeit erfolgen muss. Bei der Hintergrundkorrektur kann aufgrund des eher homogenen Hintergrundes sogar mit einer Basislinie gearbeitet werden. Gute Ergebnisse liefert auch hier der „Rolling Ball“.
- SYBR Green-Färbung
SYBR Green bindet spezifisch an Nukleinsäuren und wird insbesondere für den Nachweis von DNA verwendet. Mit wenigen Abstrichen lässt sich allerdings auch RNA gut nachweisen. Der Farbstoff lagert sich in den Strängen der Moleküle ein und gibt ein fluoreszierendes Licht ab, wenn es mit UV-Licht bestrahlt wird. Die Methode ist sehr empfindlich und kann sehr geringe Mengen von DNA detektieren. Im Vergleich zur Ethidiumbromid-Färbung ist SYBR Green weniger toxisch, allerdings teurer. Da der Nachweis mit SYBR Green sehr empfindlich ist, ist diese Methode auch anfällig für Verunreinigungen, was zu einem hohen Hintergrundrauschen führen kann.
Als Methode zur Hintergrundkorrektur sollte man demnach auch den „Rolling Ball“ verwenden. Die Detektion der Spuren und Banden ist weitgehend vollautomatisch möglich. Da es bei den Banden meist zu schrägen Lagen kommen kann, kann man das Grimassentool verwenden, um Banden zu trennen. Dies korrigiert die Lage der Bande virtuell so, dass keine Banden im Profil „ineinander laufen“ und damit sauber getrennt werden können. Wichtig ist dies vor allem bei der Quantifizierung von Banden.
Die erläuterten Methoden werden meist für eine erste Vorselektion verwendet. Wenn es jedoch darum geht, bestimmte Proteine, DNA- oder RNA-Moleküle in einer Probe zu detektieren, müssen Nachweissysteme verwendet werden, die spezifisch sind und eine Quantifizierung von klar definierten Teilen der Gesamtprobe ermöglichen. Das Ergebnis solcher Verfahren erlaubt eine Mengenbestimmung des enthaltenen Zielmoleküls innerhalb einer Probe anhand einer Kalibrierungskurve. Mithilfe von LabImage 1D kann die Analyse entsprechender Bilddateien nach konstanten Kriterien auch automatisiert erfolgen, sodass große Datenmenge rasch und reproduzierbar bearbeitet werden können. Für spezifische Nachweisverfahren gibt es grundsätzlich zwei verschiedene Möglichkeiten:
- Spezifischer Nachweis direkt auf dem Gel
Für den Nachweis bestimmter Proteine direkt im Gel kann eine Immunfärbung durchgeführt werden. Dabei wird das Gel in einer Lösung mit spezifischen Antikörpern inkubiert, die an das gewünschte Protein binden. Diese Antikörper werden dann im zweiten Schritt durch einen sekundären Antikörper markiert, der einen Farbstoff (in der Regel fluoreszierend) oder ein Enzym trägt, wodurch die Bindung schließlich sichtbar gemacht werden kann. Analog hierzu erfolgt der Nachweis bestimmter DNA- oder RNA-Stränge durch Hybridisierung. Dabei werden spezifischer Sonden verwendet, die quasi das Gegenstück des nachzuweisenden Molekülabschnittes sind und ebenfalls einen Farbstoff oder ein Enzym tragen, um die Bindung im nächsten Schritt sichtbar zu machen.
- Blotting-Verfahren
Beim Blotting werden die aufgetrennten Proben aus dem Gel auf eine Nitrozellulose- oder PVDF-Membran übertragen. Der Nachweis des spezifischen Moleküls erfolgt auch hier durch die jeweiligen speziellen Antikörper oder Sonden. Blotting-Verfahren sind in der Regel sensitiver als direkte Nachweisverfahren in dem Gel, da sie eine höhere Nachweisempfindlichkeit haben. Dies liegt daran, dass die Übertragung der Proteine oder Nukleinsäuren vom Gel auf die Blotting-Membran eine höhere Konzentration und Reinheit des Zielmoleküls ermöglicht. Allerdings sind Blotting-Verfahren auch aufwendiger und dadurch teurer als direkte Nachweisverfahren auf dem Gel. Western Blotting wird zur Detektion und Charakterisierung von Proteinen, Southern Blotting zur Detektion spezifischer DNA-Sequenzen und Northern Blotting zur Detektion von RNA-Sequenzen verwendet.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass es viele Methoden gibt, ein Gel nach der Auftrennung der Probe zu Färben. Die Wahl dieser Methode hängt von den spezifischen Anforderungen und der Verfügbarkeit von Ressourcen ab. Am Ende steht immer ein Bild mit mehreren oder einzelnen Banden, die über eine Messung der optischen Dichte quantifiziert werden können. Hierbei kann eine definierte Zielgröße sowohl qualitativ als auch quantitativ bestimmt werden. LabImage 1D kann die entsprechende Auswertung automatisiert durchführen, sodass ein großer Probendurchlauf und konstanten Vergleichsbedingungen gegeben sind. Die Genauigkeit dieser Quantifizierung steht und fällt mit der Sensitivität und Spezifität des verwendeten Nachweisverfahrens.